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Title:	Estrategia de cultivo basada en Inmunomodulacion utilizando Probióticos y Biopolímeros Inmunoestimulantes en camarones Penaeus vannamei para mitigar mortalidades causadas por Vibrio parahaemolyticus
Authors:	Rodríguez, Jenny, Director Ramírez Muñoz, Mery Rosario
Keywords:	Industria del camarón de cultivo. Bacterias del género Vibrio Vibrio parahaemolyticus causante de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) Inmunomodulacion
Issue Date:	2023
Publisher:	ESPOL.FCV
Citation:	Ramírez Muñoz, M. R. (2023). Estrategia de cultivo basada en Inmunomodulacion utilizando Probióticos y Biopolímeros Inmunoestimulantes en camarones Penaeus vannamei para mitigar mortalidades causadas por Vibrio parahaemolyticus. [Tesis Doctoral]. ESPOL.FCV .
Description:	Bacterias del género Vibrio han provocado severas enfermedades a la industria del camarón de cultivo. Vibrio parahaemolyticus causante de la necrosis hepatopancreática aguda (AHPND), ha causado grandes mortalidades y pérdidas económicas a esta industria. Este Vibrio coloniza el estómago del camarón y genera toxinas que destruyen el hepatopáncreas. La presente tesis abordó a la AHPND combinando dos enfoques, el primero la exclusión de las superficies del camarón del vibrio patógeno, mediante probióticos con altas cualidades colonizadoras y el segundo enfoque, la inmunomodulación del camarón con fibras vegetales inmunoestimulantes. La capacidad colonizadora de los probióticos estudiados (Ili, P62 y P64) se verificaron mediante observaciones en microscopía confocal y de epifluorescencia, demostrando que estas bacterias poseen abundantes flagelos (Ili), fimbrias (P62), y una combinación de fimbrias y flagelos (P64). Estos apéndices extracelulares ayudan a explicar la capacidad de adherencia de los probióticos del consorcio, así como la capacidad de formar biopelículas y la motilidad en enjambre, los cuales son procesos fundamentales para persistir y colonizar superficies externas e internas de los camarones incluyendo el estómago y la membrana peritrófica de las larvas de camarón. Entre los probióticos Ili fue el más destacado por su gran capacidad de colonización. De 18 fibras vegetales evaluadas in vitro, se seleccionaron dos, la fibra natural F4 y la fibra comercial C101 por sus cualidades inmunoestimulantes superiores a las restantes fibras y a los ?-1,3-glucanos, inmunoestimulantes usados ampliamente en acuicultura. Así en la prueba de activación de la fenol oxidasa (PO) se obtuvieron valores de 698,67 mDO ± 10,02 (fibra F4) y 586,33 mDO ± 13,32 (fibra C101). En las tasas de generación de O - los resultados fueron de 2,69 ± 0,15 (fibra F4) y 1,99 ± 0,44 (fibra C101). En los ensayos in vivo, los probióticos y las fibras vegetales seleccionadas fueron adicionados a la dieta basal, con excepción del probiótico Ili, el cual en la larvicultura se añadió en el agua. El diseño experimental comprendió 5 tratamientos. T1: Consorcio de probióticos (Ili, P62 y P64); T2: Consorcio de probióticos + fibra F4; T3: consorcio de probióticos + fibra C101; T4: fibra F4 y T5: fibra C101. Control: solo dieta basal, posteriormente a la aplicación de los tratamientos, los camarones fueron infectados con V. parahaemolyticus. En larvicultura, los tratamientos se aplicaron durante toda la cría larvaria. Probióticos y fibras vegetales afectaron la expresión de AMPs y la supervivencia. El tratamiento T3 determinó la sobreexpresión de las peneidinas semejante al tratamiento 12 T1, con la mayor supervivencia (90,44%). El tratamiento T1 (solo probióticos) reguló también la sobreexpresión de ALF y un descenso en la expresión de genes de crustinas, sin embargo, la capacidad inmunoestimulante de las fibras se reveló en el incremento de la expresión de crustinas cuando estas entraron en los dos tratamientos en combinación con los probióticos (T2 y T3). Luego de la infección con V. parahaemolyticus el análisis de supervivencia indicó diferencias en las curvas de mortalidad y valores de supervivencia más altos (p < 0,05) en larvas expuestas a los tratamientos T1 (97,8%); T2 (92,2%) y T3 (89,4%). La supervivencia del tratamiento T4 (fibra vegetal F4) fue superior al 50%, en tanto la supervivencia del control se ubicó en 23,3%. En juveniles, probióticos y fibras vegetales tuvieron un efecto positivo sobre la respuesta inmune, con incrementos en la generación del O2 - y proteínas plasmáticas. Además, los camarones tratados, exhibieron numerosos hemocitos infiltrados en los tejidos con una alta expresión de peneidinas in situ. Estos camarones mostraron altas supervivencias ante el desafío con V. parahaemolyticus. Los camarones del tratamiento T2 tuvieron la supervivencia más alta (91,1 %), seguidos por aquellos del tratamiento T1 (88,9%), y T5 (82,2%). Los camarones del tratamiento T4 presentaron una supervivencia del 73,3%. Finalmente, el tratamiento T3 terminó con el 71,4% de supervivencia. Los resultados de los ensayos in vivo realizados en larvas y juveniles indican la efectividad de combinar probióticos colonizadores con fibras vegetales inmunoestimulantes, como estrategia de protección de estos invertebrados contra Vibrio parahaemolyticus causante de AHPND.
metadata.dc.description.abstractenglish:	Bacteria of the genus Vibrio have caused severe diseases in the farmed shrimp industry. Vibrio parahaemolyticus, which causes acute hepatopancreatic necrosis (AHPND), has caused great mortality and economic losses to this industry. This Vibrio colonizes the stomach of the shrimp and generates toxins that destroy the hepatopancreas. This thesis addressed AHPND by combining two approaches, the first was the exclusion of pathogenic vibrio from shrimp surfaces using probiotics with high colonizing qualities and the second approach was immunomodulation of shrimp with immunostimulating plant fibers. The colonizing capacity of the probiotics studied (Ili, P62 and P64) was verified through observations in confocal and epifluorescence microscopy, demonstrating that these bacteria have abundant flagella (Ili), fimbriae (P62), and a combination of fimbriae and flagella (P64). These extracellular appendages help explain the adhesion capacity of the consortium's probiotics, as well as the ability to form biofilms and swarming motility, which are fundamental processes to persist and colonize external and internal surfaces of shrimp including the stomach and peritrophic membrane of shrimp larvae. Among the probiotics Ili was the most notable for its great colonization capacity. Of 18 plant fibers evaluated in vitro, two were selected, the natural fiber F4 and the commercial fiber C101 for their immunostimulant qualities superior to the remaining fibers and ?-1,3-glucans, immunostimulants widely used in aquaculture. Thus, in the phenol oxidase (PO) activation test, values of 698.67 mDO ± 10.02 (F4 fiber) and 586.33 mDO ± 13.32 (C101 fiber) were obtained. In the O - generation rates, the results were 2.69 ± 0.15 (fiber F4) and 1.99 ± 0.44 (fiber C101). In the in vivo trials, probiotics and selected plant fibers were added to the basal diet, with the exception of the probiotic Ili, which in larviculture was added to the water. The experimental design included 5 treatments. T1: Probiotic consortium (Ili, P62 and P64); T2: Probiotics + fiber F4 consortium; T3: probiotic consortium + fiber C101; T4: F4 fiber and T5: C101 fiber. Control: basal diet only, after the application of the treatments, the shrimp were infected with V. parahaemolyticus. In larviculture, treatments were applied throughout larval rearing. Probiotics and plant fibers affected the expression of AMPs and survival. Treatment T3 determined the overexpression of penisidins similar to the treatment T1, with the highest survival (90.44%). The T1 treatment (probiotics only) also regulated the overexpression of ALF and a decrease in the expression of crustin genes, however, the immunostimulating capacity of the fibers was revealed in the increase in the expression of crustins when they entered the two treatments. in combination with probiotics (T2 and T3). After infection with 14 V. parahaemolyticus, the survival analysis indicated differences in the mortality curves and higher survival values (p < 0.05) in larvae exposed to the T1 treatments (97.8%); T2 (92.2%) and T3 (89.4%). The survival of the T4 treatment (F4 plant fiber) was greater than 50%, while the survival of the control was 23.3%. In juveniles, probiotics and plant fibers had a positive effect on the immune response, with increases in the generation of O2- and plasma proteins. Furthermore, the treated shrimp exhibited numerous hemocytes infiltrated into the tissues with a high expression of peneidins in situ. These shrimps showed high survival when challenged with V. parahaemolyticus. Shrimp from treatment T2 had the highest survival (91.1%), followed by those from treatment T1 (88.9%), and T5 (82.2%). The shrimp in treatment T4 had a survival of 73.3%. Finally, treatment T3 ended with 71.4% survival. The results of in vivo tests carried out on larvae and juveniles indicate the effectiveness of combining colonizing probiotics with immunostimulating plant fibers, as a strategy to protect these invertebrates against Vibrio parahaemolyticus, which causes AHPND
URI:	http://www.dspace.espol.edu.ec/handle/123456789/60776
metadata.dc.identifier.codigoproyectointegrador:	FCV-POSTG001
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