Desarrollo de un protocolo de monitoreo de poblaciones microbianas en la fermentación del cacao usando secuenciación por nanoporos

Abstract

La fermentación del cacao es un proceso espontáneo en el que diversos microorganismos juegan un papel clave en el desarrollo de los sabores distintivos de chocolate. La microbiota de la fermentación del cacao ha sido caracterizada de forma rutinaria mediante técnicas dependientes de cultivo y secuenciación de próxima generación (NGS) utilizando la plataforma de Illumina. Sin embargo, no se ha evaluado el potencial de una tecnología de secuenciación in situ para monitorear la dinámica microbiana durante la fermentación del cacao. En este estudio, se tomaron muestras de granos de cacao Nacional x Trinitario a las 0, 24, 48, 72 y 96 horas después del inicio de la fermentación. Se extrajo el ADN total y se prepararon librerías de secuenciación para ser secuenciadas en la plataforma Illumina y MinION. Adicionalmente, los microorganismos presentes en las muestras fueron aislados utilizando métodos tradicionales dependientes de cultivos. Además, se caracterizó el perfil de polifenoles mediante UPLC-PDA y capacidad antioxidante por el método ORAC en granos de cacao con el fin de dilucidar los cambios en estos compuestos bioactivos durante la fermentación. En los niveles taxonómicos de orden y familia, las plataformas de secuenciación Illumina y MinION revelaron una composición microbiana similar en las muestras. Sin embargo, a nivel de género y especie, los resultados difirieron entre ambas tecnologías de secuenciación. En este sentido, la secuenciación Illumina reveló un predominio de Limosilactobacillus, Levilactobacillus, Lactiplantibacillus, Frauteria, Saccharomyces y Acetobacter a lo largo del período de fermentación, mientras que los resultados de la secuenciación MinION mostraron una presencia predominante de Escherichia, Salmonella, Liquorilactobacillus, Lentilactobacillus Acetobacter y Komagataeibacter. Los tres métodos fueron consistentes en la detección de las principales especies de levaduras (S. cerevisiae), bacterias ácido-lácticas (L. plantarum, L. pseudomesenteroides, L. brevis, L. hilgardii y L. mali) y de bacterias ácido acéticas (A. pasteurianus) durante la fermentación. El análisis funcional del ensamblaje híbrido de las lecturas de Illumina y MinION reveló los roles de bacterias ácido-lácticas y ácido acéticas en el metabolismo de los carbohidratos, aminoácidos, polifenoles y alcaloides para la producción de diversos metabolitos relacionados con el sabor, aroma y potencial bioactivo del cacao. Por otro lado, los contenidos de catequina y epicatequina mostraron comportamientos opuestos durante la fermentación. La actividad antioxidante incrementó hacia el final de la fermentación sin llegar a aumentar significativamente en relación con lo observado en las muestras de cacao fresco. Este es el primer informe en evaluar la aplicabilidad de la secuenciación MinION para la caracterización de la población microbiana durante la fermentación del cacao. Además, a través de la presente investigación se ha contribuido en incrementar el conocimiento acerca de la dinámica de compuestos fenólicos y actividad antioxidante durante la fermentación del cacao Nacional x Trinitario.