Secuenciación en Nanoporos para la identificación multiplex de bacterias Patógenas transmitidas por alimentos

Díaz Cárdenas, Byron Jesús

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Tesis de Maestría en Biociencias Aplicadas
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dc.contributor.advisor	Cevallos Cevallos, Juan Manuel, Director
dc.contributor.author	Díaz Cárdenas, Byron Jesús
dc.creator	ESPOL.FCV
dc.date.accessioned	2024-07-01T17:31:55Z
dc.date.available	2024-07-01T17:31:55Z
dc.date.issued	2024
dc.identifier.citation	Díaz Cárdenas, B. J. (2024). Secuenciación en Nanoporos para la identificación multiplex de bacterias Patógenas transmitidas por alimentos. [Tesis de Maestria]. ESPOL.FCV .
dc.identifier.uri	http://www.dspace.espol.edu.ec/handle/123456789/61333
dc.description	En Ecuador, la inocuidad alimentaria se ve amenazada por la presencia de bacterias patógenas en alimentos. El secuenciador MinION de Oxford Nanopore Technologies se perfila como una herramienta accesible para la detección de patógenos transmitidos por alimentos. Esta investigación evalúa su potencial para la detección simultánea de Listeria monocytogenes, Salmonella enterica y Vibrio cholerae en 12 alimentos de alto riesgo incluyendo bolones, ceviches, carne de res, encebollados, ensalada de frutas, empanadas de queso, frutas picadas, mote con chancho, pollo, quesos, salchipapas y salsas picantes. Se desarrolló un protocolo de extracción de ADN, un método de preparación de genotecas 16S y un flujo bioinformático para la detección de bacterias usando la secuenciación de nanoporos. Se evaluó la sensibilidad del equipo minION ante bajas cantidades de patógenos (10-9 , UFC/ml o UFC/g) y se compararon los perfiles microbianos con la secuenciación en Illumina. El protocolo de extracción a base de hidróxido de sodio 50 mM NaOH, obtuvo rendimientos aceptables para la secuenciación de Nanopore. La preparación de genotecas 16S rARN se logró utilizando los barcodes del kit de Nanopore y ajustando las concentraciones de los amplicones equimolarmente. El flujo bioinformático NCBI+ fue una alternativa al flujo EPI2ME oficial de Nanopore. El secuenciador Nanopore detectó Salmonella enterica y Vibrio cholerae con una abundancia relativa < 1% en la menor dilución de bacterias inoculadas (10-9 UFC). No se detectó Listeria monocytogenes en ninguna plataforma. Se identificaron potenciales bacterias patógenas de interés económico en ambas plataformas pertenecientes a los géneros de Bacillus, Campylobacter, Clostridium, Cronobacter, Escherichia, Listeria, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Vibrio y Yersinia. La secuenciación de Nanopore obtuvo un 69% de clasificación a nivel de género, mientras que Illumina alcanzó un 92%. No se encontraron diferencias significativas en la diversidad alfa y beta entre ambas plataformas, pero si se halló una correlación del 70% entre los taxones hallados. El secuenciador MinION es una alternativa a las plataformas de secuenciación NGS por su versatilidad, bajo costo de inversión inicial y rápida obtención de información de perfiles bacterianos en muestras de alimentos. Se requieren estudios adicionales para optimizar la detección de Listeria monocytogenes y aumentar la cantidad de lecturas válidas con clasificación taxonómica a nivel de género y especies
dc.format	application/pdf
dc.format.extent	62 página
dc.language.iso	spa
dc.publisher	ESPOL.FCV
dc.rights	openAccess
dc.subject	Bacterias patógenas en alimentos
dc.subject	Listeria monocytogenes
dc.subject	Salmonella entérica
dc.subject	Vibrio cholerae en 12 alimentos de alto riesgo
dc.subject	extracción de ADN
dc.subject	preparación de genotecas 16S
dc.title	Secuenciación en Nanoporos para la identificación multiplex de bacterias Patógenas transmitidas por alimentos
dc.type	Magíster en Biociencias Aplicadas con Mención en Biodescubrimiento
dc.identifier.codigoespol	T-114341
dc.description.city	Guayaquil
dc.description.degree	Escuela Superior Politécnica del Litoral
dc.identifier.codigoproyectointegrador	POSTG003
dc.description.abstractenglish	Food safety in Ecuador is threatened by the presence of pathogenic bacteria in food. The MinION sequencer from Oxford Nanopore Technologies is emerging as an accessible tool for the detection of foodborne pathogens. This research evaluates its potential for the simultaneous detection of Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, and Vibrio cholerae in 12 high-risk foods including bolones, ceviches, beef, encebollados, fruit salad, cheese empanadas, chopped fruits, mote con chancho, chicken, cheeses, salchipapas and spicy sauces. A DNA extraction protocol, a 16S library preparation method, and a bioinformatics workflow were developed for the detection of bacteria using nanopore sequencing. The sensitivity of the minION equipment to low amounts of pathogens (10-9 , CFU/ml or CFU/g) was evaluated and the microbial profiles were compared with Illumina sequencing. The extraction protocol based on 50 mM NaOH sodium hydroxide, obtained acceptable yields for Nanopore sequencing. The preparation of 16S rRNA libraries was achieved using the barcodes of the Nanopore kit and adjusting the concentrations of the amplicons equimolarly. The NCBI+ bioinformatics workflow was an alternative to the official Nanopore EPI2ME workflow. The Nanopore sequencer detected Salmonella enterica and Vibrio cholerae with a relative abundance < 1% in the lowest dilution of bacteria inoculated (10-9 CFU). Listeria monocytogenes was not detected on any platform. Potential pathogenic bacteria of economic interest were identified on both platforms belonging to the genera Bacillus, Campylobacter, Clostridium, Cronobacter, Escherichia, Listeria, Salmonella, Shigella, Staphylococcus, Vibrio and Yersinia. Nanopore sequencing obtained 69% classification at the genus level, while Illumina reached 92%. No significant differences were found in alpha and beta diversity between both platforms, but a 70% correlation was found between the taxa found. The MinION sequencer is an alternative to NGS sequencing platforms due to its versatility, low initial investment cost and rapid information acquisition of bacterial profiles in food samples. Further studies are needed to optimize the detection of Listeria monocytogenes and increase the number of valid reads with taxonomic classification at the genus and species level.